25 napos, 28°C-on történő statikus inkubáció után a *Pleurotus ostreatus* NRC620-ból származó lakkáz mutatta a legnagyobb aktivitást a gombatenyésztő táptalajban. Az enzim optimális pH-értéke 3,0, a hőmérséklet pedig 70°C volt. 2 órás, 40°C-on és 50°C-on történő inkubáció után az enzimaktivitás 68,33%, illetve 59,61%-on maradt. 2 órás, citrát-foszfát pufferben (pH 7,0) történő inkubáció után az enzimaktivitás 100%-on maradt. 10 mM MgSO₄ és CuSO₄ hozzáadása az enzimaktivitást körülbelül 21%-kal, illetve 35%-kal növelte, míg a NaCl, MnCl₂, KCl és CaCl₂ gátolta az enzimaktivitást. Az ABTS szubsztrátként való alkalmazásával a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkáz kinetikai paraméterei (Km és Vmax) 1,99 mM, illetve 16 217 μmol min−1 L−1 voltak. Az almaléminták enzimes kezelése jelentősen csökkentette mind a pH-értéket, mind a viszkozitást, és ez a csökkenés korrelált a tárolási idő növekedésével. A lakkázkezelés az almalé teljes fenoltartalmának kismértékű csökkenését eredményezte, de az antioxidáns aktivitás csökkenését nem figyelték meg.
Az utóbbi években a kutatók a zöld biotechnológia élelmiszeripari alkalmazására összpontosítottak. A lakkáz az egyik leghasznosabb enzim az élelmiszeriparban, amely olyan területeken alkalmazható, mint a gyümölcslé-feldolgozás, a sütés, a borstabilizálás és az élelmiszerek érzékszervi tulajdonságainak javítása.1Sok magasabb rendű növény és mikroorganizmus választ ki lakkázt,2és a gombák, mint például a deuteromycetes, az ascomycetes és a basidiomycetes, szintén termelhetnek lakkázt.3A lakkáz (EC 1.10.3.2) egy kék oxidáz, amely három különböző rézatomból álló rendszer segítségével redukálja a molekuláris oxigént vízzé, ezáltal oxidálja a különféle fenolos vegyületeket és aromás aminokat. A gyümölcs- és zöldséglevek előállítása során az enzimes és nem enzimes barnulás kritikus kérdés.4Mivel ezek az anyagok negatívan befolyásolják a lé színét, ízét és aromáját, el kell távolítani őket.5
Az összes gyümölcs közül az alma a legnagyobb fogyasztású világszerte és az Európai Unióban is. 2019-ben az almatermelés a harmadik helyen állt a világon, meghaladva a 87 millió tonnát.6Az alma számos fenolos vegyületet tartalmaz, beleértve a flavonoidokat és a fenolos savakat, mint például a kávésavat és a klorogénsavat.7Mivel az almalevet jellemzően tiszta formában fogyasztják, a fenolos komponensek körülbelül 50–90%-a elvész a szűrési folyamat során.8Manapság a fogyasztók hajlamosak a minimálisan feldolgozott termékeket választani, például a magas polifenoltartalmú zavaros almalevet. Magas fenoltartalma miatt azonban ez a fajta almalé különösen érzékeny az elszíneződésre és a sötétedésre.9Az almalé sötétedésének csökkentésére vagy megakadályozására különféle technológiákat alkalmaznak, beleértve a hőkezelési módszereket, például a 60–90 °C-on történő pasztőrözést.10Sauceda-Gálvez kutatása szerint azonban11A hőkezelés lebonthatja az illékony vegyi anyagokat és befolyásolhatja az almalé érzékszervi tulajdonságait. A hőkezelési módszerek alternatívái közé tartozik a szuperkritikus szén-dioxid, az ultraibolya sugárzás, az ultrahang, a magas hidrosztatikai nyomás vagy a nagynyomású homogenizálás.12Ezen technológiák hatékonysága és a megfelelő gyümölcslevek hozama az alkalmazott paraméterektől és a termékjellemzőktől függ. Széles körű elterjedésüket korlátozza a magas költségek, egyes élelmiszertermékek minőségére gyakorolt káros hatások, vagy a nem megfelelő enziminaktiváció.13,14
A lakkáz felhasználható a gyümölcslé stabilizálására és tisztítására.15Gökmen és mtsai.16javasoljuk a lakkáz használatát gyümölcslé derítéséhez, mivel hatékonyan eltávolítja a fenolos vegyületeket azáltal, hogy polimerekké vagy oligomerekké alakítja azokat, amelyek könnyen eltávolíthatók bármilyen ultraszűrő membránnal, lehetővé téve, hogy az almalé akár hat hétig is stabil színt és átlátszóságot tartson fenn 50°C-on. A tisztított *Trichoderma* lakkázt alumínium-oxid gyöngyökre rögzítették, és az almalé mikrobiális szennyeződése által okozott ízzavaró vegyületek szelektív eltávolítására használták.17
Az almalé illékony összetevőinek körülbelül 80-90%-át észterek és aldehidek teszik ki, amelyek egyedi aromát kölcsönöznek a lének.18Az almalé derítéséhez a *Trametes versicolor* lakkázát egy olcsó, fiatal kókuszdióhéj természetes rostjából készült hordozóra rögzítették.19Korábbi tanulmányok az almalé stabilizálását (szín és zavarosság) vizsgálták enzimmentes vagy immobilizációs módszerekkel, illetve ultrafiltrációval kombinálva.5,19A gombalakkázok hatása az almalé fizikai-kémiai tulajdonságaira a tárolás során azonban továbbra sem tisztázott. Ezért a jelen tanulmány célja az almalé fizikai-kémiai tulajdonságaiban, fenolvegyület-tartalmában és antioxidáns aktivitásában bekövetkező változások kísérleti vizsgálata volt a gombalakkázokkal történő kezelés és a kéthetes hűtőszekrényben történő tárolás után. A lakkázok képesek oxidálni a fenolvegyületeket, ami ígéretessé teszi őket különféle ipari folyamatokban, beleértve a lé derítését is, való felhasználásra. Ez a tanulmány a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkázait vizsgálta, különös tekintettel az aktivitásuk és a lé derítésében való hatékonyságuk ideális körülményeire. Míg a laskagombával (P. ostreatus NRC 620) kapcsolatos kutatások még mindig korlátozottak, korábbi tanulmányok különböző gombaforrásokból, például a Trametes versicolorból és a Ganoderma lucidumból származó enzimeket vizsgáltak. A jelen tanulmány célja az enzim élelmiszeripari alkalmazásának lehetséges értékelése, valamint egyedi tulajdonságainak, különösen ideális pH-értékének és hőmérsékletének kiemelése volt.
A 2,2′-azooxibisz(3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsavat) (ABTS) a Sigma-Aldrich-tól (Kanada) vásároltuk. Minden más reagens analitikai minőségű volt.
A Nemzeti Kutatóközpont Mikrobiális Kultúra Gyűjteményi Központja beszerezte az ismert NRC620 laskagomba törzset. A szubkultúra után ezt a törzset burgonya-dextróz agar lemezeken tárolták 4°C-on. Az inokulum előkészítésének módja a következő volt: 10 napos, teljesen kifejlett micéliumot burgonya-dextróz agar lemezekre oltottak, és 28°C-on inkubálták. 10 nap elteltével három 12 mm átmérőjű micéliumblokkot távolítottak el az agar táptalajról egy steril fémlyukasztóval, és 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokba helyezték, amelyek 50 ml sterilizált táptalajt (pH 5,0, Othman és munkatársai által korábban leírtak szerint) tartalmazó vattadugóval voltak ellátva.20A tenyészeteket 28°C-on inkubáltuk 18 napig. A tenyészeteket ezután Whatman No. 1 szűrőpapíron szűrtük, és a kapott felülúszó szolgált enzimforrásként.
A lakkáz aktivitást ABTS szubsztrát alkalmazásával határoztuk meg. A reakcióelegy (2 ml) 500 μl 0,3 mM ABTS-t (0,1 M nátrium-citrát pufferben, pH 4,5 oldva) és a szükséges mennyiségű, desztillált vízzel hígított enzimmintát tartalmazott.21,22Tekintettel arra, hogy a lakkáz szobahőmérsékleten (28 °C ± 2) képes oxidálni az ABTS-t, az ABTS oxidációját a 420 nm-en mért abszorbancia növekedésének mérésével határoztuk meg (ε420= 36 000 cm3-1 M -1) Agilent Carry-100 UV spektrofotométerrel. Egy egységnyi lakkáz aktivitásra volt szükség percenként 1 μmol ABTS oxidálásához. A fehérjekoncentrációt Bradford-módszerrel határoztuk meg, belső kontrollként marhaszérumalbumint használva.23,24
Miután az enzimet kinyertük az NRC 620 laskagomba törzsből, aktivitását különböző tenyésztési időközönként mértük 25 napon keresztül statikus körülmények között, 28 °C-on.
A hőmérséklet lakkáz aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálatához kísérleteket végeztünk 20 és 90 °C közötti hőmérséklet-tartományban. Az enzim hozzáadása és a reakció megkezdése előtt a puffert (0,1 M nátrium-citrát, pH 4,5) és a szubsztrátot (ABTS) összekevertük, és 5 percig különböző hőmérsékleteken inkubáltuk. Az enzim termikus stabilitását 0,05 M nátrium-foszfát pufferben (pH 7,0) 40, 50, 60 és 70 °C-on 2 órán át történő inkubálással értékeltük. A maradék aktivitást ezután az ABTS szubsztrát segítségével értékeltük.
A pH lakkáz aktivitásra gyakorolt hatását ABTS szubsztrátként történő alkalmazásával vizsgáltuk 0,1 M citrát-foszfát pufferekben, 2,5 és 7,0 közötti pH-tartománnyal. Az enzimoldatot 40°C-on két órán át inkubáltuk 0,1 M citrát és Tris pufferekben (pH 3, 4, 6 és 7) a pH-stabilitás felmérése érdekében. Az ABTS szubsztráttal maradt maradék aktivitást az inkubáció után számítottuk ki.
A lakkázt 10 percig inkubáltuk nátrium-foszfát pufferben (0,05 M, pH 7,0), amely különböző fémionokat (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ és Mn2+) tartalmazott 2,5 mM, illetve 10 mM koncentrációban. Ezután hozzáadtuk a szubsztrátot (ABTS) a reakció megindításához, és meghatároztuk a relatív aktivitást.
Az ABTS lakkáz általi oxidációját különböző koncentrációkban (0,025–3 mM) pH 4,5-nél mértük a kinetikai paraméterek (Vmax és Km) meghatározásához. A kinetikai paraméterekkonstansokA Michaelis-Menten egyenlet kinetikai állandóit Lineweaver-Burk diagrammal számítottuk ki, amely a reakciósebesség reciprokát ábrázolja a szubsztrátkoncentráció függvényében. A kinetikai állandókat a Lineweaver-Burk diagramból számítottuk ki a GraphPad Prism 6.01-es verziójú szoftver segítségével.
Miután az almákat alaposan lemostuk csapvízzel, félbevágtuk őket, és egy teljesen automata Braun MP80 almafacsaróval (Németországban gyártott) kifacsartuk a levét. A levet négy réteg sajtkendőn szűrtük át. A kontrollcsoporthoz nem adtunk enzimeket, míg a frissen készített almaléhez 2,0% lakkázt (a tesztelt leghatékonyabb koncentrációt) adtak, majd a lét két hétig 4°C-on tároltuk.
A titrálható savasságot (TA) és a pH-t Boulton és munkatársai módszerével határoztuk meg.al.27Minden egyes minta pH-értékét digitális pH-mérővel (JENWAY 3510 pH-mérő) mértük. A titrálható savasságot (TA) az almasav alapján számítottuk ki a következő képlettel.
Ahol V és C a titrálás során használt nátrium-hidroxid oldat térfogata (ml) és koncentrációja (0,1 mol/l). K az almasav konverziós együtthatója, amely 0,067-nek felel meg, W pedig az almalé tömege (g).
Az összes oldható szilárd anyag (TDS) minden gyümölcsléminta ) tartalmát PAL-1 zsebrefraktométerrel (ATAGO, Tokió, Japán) határoztuk meg. Minden mérés után az optikai lencsét ioncserélt vízzel öblítettük, és minden almalémintát háromszor teszteltünk. Az egyes minták értékét a három mérés átlagolásával számítottuk ki. Az egyes almaléminták átlagát ± szórást szintén ezen eredmények átlagolásával számítottuk ki.
Az almalé minták viszkoelaszticitását rotációs viszkoziméterrel (RV, Rheotest 2, Németország) értékeltük. A mintát a viszkoziméter „S2” hengerébe helyeztük. A látszólagos viszkozitást a nyírófeszültség-nyírási sebesség görbe meredeksége jelentette, amelyet a nyírófeszültségből és a megfelelő görbékből számítottunk ki különböző nyírási sebességeknél (1,00-tól 437,4 s⁻¹-ig). A látszólagos viszkozitás kiszámításának képlete a következő:
Ahol η a látszólagos viszkozitás (cP), τ a nyírófeszültség (dyn/cm²), γ a nyírási sebesség (sec⁻¹), és (τ) a nyomaték (α) és a henger (Z) értékeinek felhasználásával számítható ki a következő képlettel: τ = Z . α.
A barnulási indexet Meidav és munkatársai módszerével határoztuk meg.al.29Egy 10 ml-es lémintát 2750 xg-vel 10 percig centrifugáltunk. A lé felülúszójának 5 ml-ét 5 ml 95%-os etanollal kevertük össze. A keverék abszorbanciáját 420 nm-en mértük Shimadzu UV spektrofotométerrel (UV-1601 PC).
A teljes fenoltartalmat (TPC) kolorimetriásan határoztuk meg Folin-Ciocalteu reagenssel, Boulton és munkatársai által leírtak szerint.[27]. A gallussav standard görbéjét 0 és 500 mg/l közötti koncentrációk esetén készítették el (r²= 0,997). Az eredményeket gallussav-ekvivalensben (mg GAE/ml) fejezzük ki.
Adjunk 125 μl desztillált vizet és 2850 μl FRAP-oldatot 25 μl almaléhez, majd hagyjuk a keveréket sötétben...30perc. Ezután mérjük az abszorbanciát 593 nm-en Shimadzu UV spektrofotométerrel (UV-1601 PC). A FRAP reagenst úgy készítettük el, hogy 300 mM acetát puffert (pH 3,6), 20 mM vas(III)-kloridot és 10 mM 2,4,6-trisz(2-piridil)triazint (TPTZ) (40 mM HCl-ben oldva) 10:1:1 arányban összekevertünk. Standard görbét készítettünk Trolox standardként való felhasználásával (R²= 0,999), és az eredményeket μM Trolox/ml-ben fejezzük ki.
A kezelt és kezeletlen levek antioxidáns aktivitását DPPH módszerrel határoztuk meg, hogy kiértékeljük a DPPH szabadgyökök megkötésére való képességüket.31Tíz mikroliter levet összekevertek 1 ml metanolos DPPH-oldattal (100 μM). Miután a reakciót 30 percig sötétben végezték, az elegy abszorbanciáját 517 nm-en mérték Shimadzu UV spektrofotométerrel (UV-1601 PC). Az eredményeket trolox-ekvivalensben (μM trolox/ml) fejezték ki egy kalibrációs görbe alapján (R2= 0,990).
A kapott adatok azt mutatták, hogy az NRC 620 laskagombákban a fermentáció 18. napjának végére figyeltek meg maximális lakkáztermelést, elérve az 1302 U/L aktivitást. Ez szolgált az alapjául a lakkáztermelés optimális tenyésztési idejének meghatározásához (1. ábra). Bár az enzimtermelés a tenyésztési idő növekedésével nőtt, a növekedés üteme nem volt egyenesen arányos a tenyésztési idővel; 21 nap elteltével az enzimaktivitás mindössze 90 U/L-rel nőtt (1390 U/L-re). Ezért végül a 18 napot választották optimális tenyésztési időnek, hogy egyensúlyt teremtsenek a termékhozam és a megnövekedett tenyésztési idő gazdasági előnyei között.
A tenyésztési idő hatása a lakkázhozamra Pleurotus ostreatus NRC 620 törzsben. Három (12 mm-es) gombamicélium-blokkot oltottunk be 50 ml steril táptalajba, majd 28 °C-on tenyésztettük különböző ideig.
Más tanulmányokkal összhangban eredményeink azt mutatják, hogy a gombák általi lakkáz szekréció csúcsának eléréséhez ideális tenyésztési időszak valószínűleg 7 és 36 nap között van.32Ezike és munkatársai szerint33A *Trametes polyzona* WRF03 törzs a fermentáció kilencedik napjának végére termelte a legnagyobb mennyiségű lakkázt, 1637 U/mg fehérje fajlagos aktivitással. Továbbá Othman és munkatársai...34megállapította, hogy a *Trichoderma harzianum* S7113 nagy mennyiségű lakkázt választott ki a tenyésztés ötödik napján. A lakkáz termelési ráta a tizennegyedik napon érte el a csúcsot, majd fokozatosan csökkent.34Bár az enzimszekréció a fő növekedési fázisban is előfordulhat, általában a köztes fázisban éri el a csúcspontját, és egy szén- vagy nitrogénforrás fogyasztása váltja ki.34,35
Bár a Pleurotus ostreatus NRC 620-ból származó lakkáz széles hőmérsékleti tartományban, 50°C és 80°C között magas aktivitást mutatott, közel a csúcsaktivitáshoz (69–98%), maximális aktivitását 70°C-on figyelték meg (2a. ábra). Ezen a hőmérsékleti tartományon kívül az enzimaktivitás körülbelül 70°C-on csökkent. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az enzim magas hőmérsékleten aktív, valószínűleg azért, mert a magas hőmérséklet növeli a reakció kinetikus energiáját.
A reakcióhőmérséklet (a) és a pH (b) hatása a lakkáz aktivitására *Pleurotus ostreatus* NRC 620 törzsben. A 20 és 90 °C közötti hőmérsékletet úgy érték el, hogy a keveréket 5 percig különböző hőmérsékleteken előinkubálták, mielőtt hozzáadták az enzimet és megindították a reakciót. A pH lakkáz aktivitásra gyakorolt hatását ABTS szubsztrátként történő alkalmazásával értékelték 0,1 M citrát-foszfát puffert tartalmazó oldatokban, 2,5 és 7,0 közötti pH-tartományban.
Ezike és mások szerintal.33A *Trametes polyzona* WRF03 lakkáz optimális hőmérséklete 55 °C, ami megegyezik a *Ganoderma lucidum* hőmérsékletével.laccase36és hasonló a *Trametes polyzona* KU-RNW02737 optimális hőmérsékletéhez (50 °C)lakkáz . Baldrian38megjegyzi, hogy a többi ligninlebontó enzimrendszerhez hasonlóan a lakkáz ideális hőmérsékleti tartománya 50 és 70 °C között van.
Az eredmények azt mutatták, hogy az enzim pH 3,0-nál mutatta a legnagyobb aktivitást, elérve a 94%-os aktivitást pH 3,5-nél. Azonban széles pH-tartományban, 2,5 és 7,0 között aktív maradt (2b. ábra). Továbbá savas körülmények között nagyobb aktivitást mutatott a semleges vagy lúgos körülményekhez képest. Aktivitása legalább 77%-os maradt a 2,5 és 4,5 közötti pH-tartományban, de pH 7,0-nél csak körülbelül 38%-ot ért el. A *Trametes polyzona* WRF03-ból származó lakkáz optimális pH-értéke 4,533 volt, ami megegyezik a *Trametes polyzona* KU-RNW02737, a *Trichoderma harzanium* 39, a *Pleurotus* sp. 40 és a *Trametes hirsuta* 41 lakkázainak pH-értékével. Chairin és munkatársai tanulmánya szerint azonban...42A *Polymorpha f. sp.* WR710-1 lakkázának optimális pH-ja 2,2, míg a *Polymorpha f. sp.* IBL-04 lakkázának optimális pH-ja 5,043. A hidroxid anionok (lakkáz inhibitor) kötődése a T2/T3 lakkáz rézatomjaihoz okozhatja a lakkáz aktivitásának csökkenését semleges vagy lúgos pH-körülmények között. Ez megzavarhatja a belső elektronátvitelt a T1 központból a T2/T3 központba, ezáltalkorlátozóaz enzimaktivitás23,44
Az enzim különböző hőmérsékleteken történő inkubálásával azt tapasztalták, hogy mind az inkubációs idő, mind a hőmérséklet befolyásolta az enzim stabilitását. Figyelemre méltó, hogy a *Trametes polyzona* NRC 620-ból származó lakkáz nagyobb stabilitást mutatott 40℃-on és 50℃-on, 120 perc elteltével kezdeti aktivitásának 68,33%-át, illetve 59,61%-át megtartva (3a. ábra). Ezzel szemben azonos körülmények között (40℃ és 50℃, 120 perc) a *Trametes polyzona* WRF03-ból származó lakkáz aktivitásának 64,38%-át, illetve 42,92%-át megtartotta.33Ezzel szemben az inkubációs idő és a hőmérséklet növelése csökkentette a *Trametes polyzona* NRC 620 lakkáz stabilitását; 60℃-on és 70℃-on 60 percig történő inkubálás után aktivitása 39,24%-ra, illetve 1,72%-ra csökkent (3a. ábra). A kísérleti eredményekkel összhangban a *Trametes polyzona* WRF03 lakkáza nagyobb stabilitást mutatott 40 és 50℃-on a hőkezelési folyamat során.33Hasonlóképpen, Lueangjaroenkit és másokal.37és Chairin és másokal.42A Trametes polyzona KURNW027 és a Trametes polyzona WR710-1 lakkázok stabilitásáról számoltak be 50 °C-on 1 órán át. Mint hasznos biokatalizátor, amely különböző biotechnológiai területeken alkalmazható, a lakkáznak jó stabilitással és teljesítménnyel kell rendelkeznie széles hőmérsékleti tartományban.
A *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkáz termosztatikus stabilitása (a) és pH-stabilitása (b). A termosztatikus stabilitást úgy értékeltük, hogy az enzimoldatot 0,05 M nátrium-foszfát pufferben (pH 7,0) 40, 50, 60 és 70 °C-on 2 órán át inkubáltuk. A pH-stabilitást úgy értékeltük, hogy az enzimoldatot 0,1 M citrát pufferben és Tris pufferben (pH 3, 4, 6 és 7) 40 °C-on 2 órán át inkubáltuk. A maradék aktivitást az inkubáció után ABTS szubsztrátként történő alkalmazásával számítottuk ki.
Az enzimfelhasználás és -tárolás optimális körülményeinek meghatározása érdekében megvizsgáltuk a pH hatását a lakkáz stabilitására. A különböző pH-értékeknek való kitettség jelentősen befolyásolta a fehérjeszerkezet stabilitását, ezáltal befolyásolva az enzimmolekula stabilitását és aktivitását. Az eredmények azt mutatták, hogy az enzim savas körülmények között kevésbé stabil, míg magasabb pH-értékeken (semleges és lúgos régiókban) jobb stabilitást mutatott. 7,0, 6,0, 4,0 és 3,0 pH-értékeken az enzim retenciós aránya 120 perc elteltével körülbelül 100%, 62,54%, 52,39% és 11,14% volt (3b. ábra). A *Strombus multisus* WRF03 lakkáz nagyobb stabilitást mutatott semleges pH-értékeken (5,5–6,5), és alacsonyabb stabilitást savas pH-értékeken (4,0 alatt). 120 perc elteltével, 5,5, 6,0 és 6,5 pH-értéken az enzimretenciós arány körülbelül 82%, 100% és 93% volt.33Khairin és mtsai.42megjegyezte, hogy a Trametes polyzona WR710-1-ből származó lakkáz stabil 6,0 és 7,0 közötti pH-tartományban, míg Sayed és munkatársai45kimutatta, hogy a lakkáz stabilabb semleges pH-körülmények között. A Cerrena unicolor lakkáza azonban lúgos körülmények között (pH 9,0) is stabilitást mutatott.46A vizsgált lakkázok széles pH-tartományban nagy stabilitást mutattak. Ez fontos jellemző lehet az ipari alkalmazások szempontjából.
Mivel egyes fémionok stimuláló és gátló hatással is rendelkeznek az enzimaktivitásra, az enzimaktivitásra gyakorolt hatásukat figyelembe kell venni az ipari alkalmazásokban. Ez azért kulcsfontosságú, mert a fémionok gyakori környezeti szennyező anyagok, amelyek befolyásolhatják az extracelluláris enzimek stabilitását és szintézisét.47Több fémion *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkázra gyakorolt hatásának vizsgálatához megfelelő kísérleteket végeztünk. Amint a 4. ábra mutatja, a használt fém típusától függően a fémion-koncentráció 2,5 mM-ról 10 mM-ra történő növelése negatívan befolyásolta az enzim működését. Például,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, ésCu²⁺serkentheti és aktiválhatja az enzimaktivitást, miközbenNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, ésK⁺gátolhatja az enzimaktivitást. 10 mM koncentrációban a Cu²⁺ és Mg²⁺ ionok voltak a lakkáz aktivitásának leghatékonyabb aktivátorai a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 esetében, körülbelül 34%, illetve 20%-os aktivációs fokot biztosítva. 10 mM koncentrációban azonban a Ca²⁺ ionok voltak a lakkáz leghatékonyabb inhibitorai, körülbelül 60%-kal csökkentve az enzimaktivitást.
Fémionok hatása a Pleurotus ostreatus NRC 620 lakkáz aktivitására. A lakkázt 10 percig nátrium-foszfát pufferben (0,05 M, pH 7,0) inkubáltuk, amely különböző fémionokat tartalmazott 2,5 mM és 10 mM koncentrációban. A reakciót ezután a szubsztrát (ABTS) hozzáadásával indítottuk el, majd megmértük a relatív aktivitást.
Eredményeink összhangban vannak más szerzők eredményeivel, akik azt találták, hogy a Mg²⁺ és a Cu²⁺ fokozza a *Trametes polyzona* WRF03³ aktivitását. Castaño és munkatársai⁴⁸ kimutatták, hogy a *Xylaria* sp. lakkázát bizonyos mértékig stimulálják a rézionok (Cu²⁺). Továbbá Foroutanfar és munkatársai⁴⁹, valamint Si és munkatársai⁵⁰ hasonló vizsgálatokat végeztek a *Paraconiothyrium variabile*, illetve a *Trametes pubescens* lakkázain. Ennek az enzimnek a II. típusú rézkötőhelye (T2) adott koncentrációban telíthető Cu²⁺-val, ami magyarázhatja a lakkáz aktivitás stimulációját magasabb Cu²⁺³⁹ koncentrációknál. Mivel a fehérrothadást okozó gombák lakkázai több rézatomot tartalmazó oxidázok, a rézionok lakkáz aktivitásra gyakorolt hatása sokrétű, és a stimulálótól és gátlótól a semlegesig terjed.⁵¹ Ezzel szemben Zhou és munkatársai. [52]arról számolt be, hogyCu²⁺gátolta a tajvani földalatti termesz (Odontotermes formosanus) lakkáz aktivitását. Azonban a Cerena sp. HYB07 lakkázai[53]és a Clitocybe maxima[54]nem voltak hatással a rézionokra.
A szubsztrátspecificitást a kinetikai paraméterei (Km és Vmax) fejezték ki; minél erősebb a szubsztrát kötődési affinitása az enzimhez, annál alacsonyabb a Km érték és annál nagyobb a szubsztrátspecificitás.3,21,55A *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ból származó lakkáz kinetikai paramétereit (Km és Vmax) a GraphPad Prism 6.0 szoftverrel határoztuk meg a Lineweaver-Burk diagram ábrázolásával (5. ábra). ABTS szubsztrátként történő alkalmazása esetén az eredmények 1,99 mM és 16217 μmol voltak.perc⁻¹ L⁻¹,Elsayed és mtsai.21arról számoltak be, hogy az ABTS oxidációjának Km-értékei 0,1 mM, illetve 0,064 mM voltak, ami a Lac A és Lac B izoenzimek ABTS iránti nagy affinitását jelzi. Továbbá a Vmax-értékek 0,182 μmol voltak.perc⁻¹és 0,603 μmolperc⁻¹A kapott Km érték alacsonyabb volt, mint a Trametes polyzona WRF03 esetében (8,66 mM); továbbá a Vmax értékük (1429 mmol/perc) isalacsonyabbamikor ABTS-t használtunk szubsztrátként.33 Hasonlóképpen, a Lentinus squarrosulus MR13 és a Trametes sp. AH28-2 lakkáz koncentrációjának Km-értékei 0,0714 mM, illetve 0,025 mM voltak, a Vmax értékek pedig 0,0091 mM min−1 és 0,67 mM min−1 mg−1 voltak (az ABTS-hez viszonyítva)., rendre.56,57
Az ABTS-koncentráció hatását a *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ból származó lakkáz aktivitására vizsgálták, és Lineweaver-Burk diagramot készítettek a kezdeti reakciósebesség és az ABTS-koncentráció reciprokáról. Az ABTS oxidációs reakcióját különböző lakkázkoncentrációk (0,025–3,0 mM) mellett pH 4,5-ön mérték a kinetikai paraméterek (Vmax és Km) meghatározásához. A Michaelis-Menten kinetikai állandókat a reakciósebesség és a szubsztrátkoncentráció reciprokának Lineweaver-Burk diagramjával számították ki. A kinetikai állandókat a Lineweaver-Burk diagramból számították ki a GraphPad Prism 6.01 szoftver segítségével.
A hagyományos derítő enzimek, mint például a pektinázok, hidrolizálják a pektintartalmú anyagokat, csökkentve a viszkozitást és a zavarosságot. Hatékonyan lebontják a strukturális poliszacharidokat, és gyakran használják más enzimekkel, például cellulázokkal és hemicellulázokkal kombinálva a hozam és az átlátszóság javítása érdekében. A pektinázok azonban nem célozzák meg kifejezetten a fenolos vegyületeket, amelyek a zavarosság és az oxidatív barnulás fő okozói, különösen a gyümölcslevekben, például az alma- és a szőlőlében.58Ezzel szemben a lakkázok katalizálják a fenolos vegyületek oxidációját, polimerizálva azokat nagyobb, oldhatatlan molekulákká, amelyek ülepítéssel vagy szűréssel eltávolíthatók. Ez a mechanizmus nemcsak a tisztaságot javítja, hanem a lé eltarthatóságát is meghosszabbítja azáltal, hogy csökkenti a fenolos vegyületek által okozott oxidatív barnulás valószínűségét. Továbbá, a lakkáz alapú derítési folyamatok enyhe feldolgozási körülmények között (pH 3,5–5,5, hőmérséklet 25–40 °C) végezhetők, így alkalmasak finom levek előállítására anélkül, hogy azok tápértékét vagy érzékszervi tulajdonságait veszélyeztetnék.59Tanulmányok kimutatták, hogy a pektinázos kezelés 1-2 óra alatt képes tisztítani a levet, míg a lakkázos kezelés jellemzően hosszabb reakcióidőt igényel (3-6 óra) a fenolos vegyületek teljes redukálásához. Ez a folyamat azonban optimalizálható az enzim immobilizálásával vagy a lakkáz mechanikai tisztítási módszerekkel kombinálásával.60Ebben a vizsgálatban a nyers kivonat enzimprofilozása jelentős lakkáz és α-amiláz aktivitást mutatott ki, míg a pektináz és xilanáz aktivitás rendkívül alacsony volt, és celluláz aktivitást nem mutattak ki. Ezért a turbiditás és a fenoltartalom csökkenése főként a lakkáz hatásának volt köszönhető, míg a viszkozitás változása részben az amiláz hatásának tudható be.
Az 1. táblázat a frissen facsart almalé és a lakkázzal kezelt minták fizikai-kémiai paramétereit mutatja. Az eredmények azt mutatták, hogy a frissen facsart almalé hozama (71,59%) alacsonyabb volt, mint a lakkázzal kezelt mintáké (87,34%). Ezek az eredmények összhangban vannak Pilnik és Orange megállapításaival.61, akik jelezték, hogy az enzimek használata a gyümölcsfeldolgozásban növelheti a léhozamot, javíthatja a szűrést, és kiváló minőségű, tiszta, sűríthető levet eredményezhet. A léhozam növekedése főként a lében oldható cukrok tartalmának növekedésének köszönhető. A gyümölcsök enzimes hidrolízise során a termék sejtfalában található mezoglea és pektin elbomlik, és oldható anyagokká, például semleges cukrokká és savakká alakul.62.Az enzimmel kezelt almalé pH-értéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoporté (P < 0,05), és mindkét csoport pH-értéke szignifikánsan emelkedett a tárolás során (1. táblázat). Ezek az eredmények összhangban vannak Mark és munkatársai eredményeivel.63, akik megjegyezték, hogy a kesudió gyümölcslé pH-értéke a hőkezelést követő tárolást követően csökkent. A pektin lebomlása és a galakturonsav képződése az enzimkezelés után felelős lehet a pH-érték tárolás közbeni növekedéséért. Az enzimmel kezelt minták pH-értéke a tárolás során 4,05 és 4,31 között maradt, míg a kezeletlen almalé pH-értéke 4,12 és 4,33 között változott.
Mind a kezeletlen, mind a lakkázzal kezelt minták teljes savtartalma (TA) csökkenő tendenciát mutatott a tárolási idő növekedésével (1. táblázat). A savasság csökkenését a szerves savak szénhidráttá történő átalakulásának vagy enzimatikus reakcióknak, valamint a létárolás során fellépő oxidációnak tulajdonították.64A kontroll almalé és az enzimmel kezelt minták összes savtartalma alacsonyabb volt, mint más leveké (eperlé 0,9%, szilvalé 2,2%, kumkvatlé 1,0%, sárgabaracklé 2,4%, narancslé 0,8%), de hasonló más levekéhez (pl. körtelé 0,3%).62A kezeletlen, frissen facsart almalében mutatkozó különbségek számos tényezőnek tudhatók be, mint például a termesztési körülmények, a genetikai tényezők, az érettségi szint és a feldolgozási módszerek.65A kontroll és a lakkázzal kezelt almalé teljes savtartalmának csökkenése összhangban van Singh és munkatársai által bemutatott eredményekkel.66a Jin Nuo almalé teljes savtartalmának csökkenéséről 74 napos tárolás után. Másrészt Oshmiansky és Wojdylo67nem találtak szignifikáns változást az almalé savasságában a hagyományos derítési módszerek hatását vizsgálva.
Az 1. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a lakkázzal kezelt almalé összes oldható szárazanyag-tartalma (TSS) magasabb volt, mint a kezeletlen mintáé. Ezek az eredmények összhangban vannak a publikált tanulmányokkal.. 68Továbbá az 1. táblázat azt mutatja, hogy a kontroll almalé csoport TSS-értéke a kezdeti időpontban 9,58 volt, a tárolási időszak végére pedig elérte a 11,05-öt. Ezek az értékek alacsonyabbak, mint a Hamid és munkatársai által közölt friss almalé TSS-értékei.. 69(11,2, illetve 11,80). A lakkázzal kezelt almaléminták TSS-értéke jelentősen nőtt, 11,23-ról indulva, két hét 4°C-on történő tárolás után 12,93-ra emelkedett (1. táblázat). Hasonló TSS-növekedést figyeltek meg a tárolás során citrusfélék, citrom és édes narancs esetében is. A teljes oldható szilárdanyag-tartalom (TSS) tárolás közbeni növekedése oka lehet a poliszacharidok (keményítő) monoszacharidokká (cukrok) történő hidrolízise, a lé kiszáradása miatti koncentrációnövekedés, valamint a lében lévő pektin oldható szilárd anyagokká történő lebomlása. A teljes oldható szilárdanyag-tartalom (TSS) növekedése valószínűleg az oldható cukrok növekedésének köszönhető, amelyek a pektin vagy a cellulóz oldható cukrokká történő átalakulásával keletkezhetnek pektin, illetve celluláz által, illetve a keményítő cukrokká történő hidrolízisével, amint azt Hamed és munkatársai is közölték.69.A lakkáz almalé tulajdonságaira gyakorolt hatása vizuálisan megfigyelhető, mivel a lakkázzal kezelt almalé jobb folyóképességet és alacsonyabb viszkozitást mutat, mint a kezeletlen lé. Ezt a megfigyelést az 1. táblázat tartalmazza; Az enzimmel kezelt minta viszkozitása 1,87 cP volt, míg a kontrollminta viszkozitása 2,95 cP. A viszkozitásnak ez a jelentős csökkenése valószínűleg a pektinszerű anyagok nagyobb vízmegtartó képességének és a kohezív hálózati szerkezet kialakulásának köszönhető.
Ebben a tanulmányban a lakkáznak az almalé barnulási indexére (BI) gyakorolt hatását vizsgáltuk az abszorbancia 420 nm-en történő mérésével spektrofotométerrel. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. Tárolás során az almaléminták BI-je mind a kezelt, mind a kezeletlen csoportban fokozatosan növekvő tendenciát mutatott. A BI a barnulás mértékét tükrözi, és indexként szolgálhat.egy fontosaz enzimes és nem enzimes barnulási reakciók indikátora. Az abszorbancia a tárolás során jelentősen megnőtt (P < 0,05). A tárolás végén aA420Az almalé minták értéke a kontroll és az enzimmel kezelt csoportokban körülbelül 217%-kal, illetve 121%-kal nőtt (1. táblázat). Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimkezelés hatékonyan csökkentheti a barnulás mértékét körülbelül 56%-kal. Bezerra és munkatársai eredményei...[19] összhangban vannak az eredményeinkkel; Lakkáz-glutaraldehid-kókuszrostot használtak az almalé derítésére, ami 61%-kal csökkentette annak eredeti színét.
Bár a gyümölcslevekben található polifenolok pozitív táplálkozási és terápiás hatással vannak az emberi szervezetre, reakcióba léphetnek a fehérjékkel is, ami lé zavarosságot, üledékképződést vagy turbiditást okozhat, ezáltal megváltoztatva a termék ízét és aromáját, és csökkentve eltarthatóságát.71A tanulmány célja az almalé fenolos vegyület tartalmának biztonságos csökkentése volt a Pleurotus ostreatus NRC 620-ból származó lakkáz felhasználásával. Az 1. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a lakkázzal kezelt almalé teljes fenolos vegyülettartalma szignifikánsan csökkent a 4 °C-on történő tárolás előtt. Továbbá a teljes fenolos vegyülettartalom a tárolás során is csökkent mindkét vizsgált mintában (1. táblázat). Sandri és munkatársai kutatása...72kimutatta, hogy az enzimmel kezelt almalé megőrzi antioxidáns aktivitását és fenolvegyület-tartalmát. Lettera és munkatársai által végzett tanulmány eredményei azonban...73kimutatható, hogy a narancslé gombás lakkázzal történő kezelése akár 45%-kal is csökkentheti a benne lévő fenolos vegyületek tartalmát.
A fenolos vegyületekről kimutatták, hogy olyan tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a szabadgyökök megkötése, a szingulett oxigén redukciója és kioltása, a hidrogénatom átvitele, valamint az elektrondonorálás a szabad gyökökhöz, így hatékony antioxidánsok.74Ezért ebben a tanulmányban DPPH és FRAP alapú módszereket alkalmaztak a lakkáz 14 napig hűtőszekrényben tárolt almalé antioxidáns aktivitására gyakorolt hatásának értékelésére (2. táblázat). Mindkét módszer az antioxidáns aktivitás növekedését mutatta ki a tárolás során, ami a szabad fenolos vegyületek mennyiségének növekedésének vagy a Maillard-reakciótermékek (MRP-k) képződésének tudható be, ahol a Maillard-reakciótermékek valószínűleg az antioxidáns aktivitás növekedésének okai.75A nem enzimatikus barnulási reakciók (beleértve az aszkorbinsav lebontását, a Maillard-reakciókat és a cukrok savkatalizált lebontását) barna pigmenteket (melanoidineket) eredményeznek. Az aszkorbinsav köztes bomlástermékei és a cukor lebomlási termékei (például karbonilvegyületek) Maillard-reakciókon keresztül reagálhatnak aminosavakkal.76Bár a gyümölcsök és zöldségek tárolás közbeni barnulását széles körben tanulmányozták, ezen reakciókról alkotott ismereteink továbbra is korlátozottak.77A FRAP módszerrel összehasonlítva a lakkázzal kezelt almalé szignifikánsan alacsonyabb antioxidáns aktivitást mutatott a DPPH módszerrel (2. táblázat), és az összes minta antioxidáns aktivitása szignifikánsan nőtt a tárolási idő növekedésével. Ebben a vizsgálatban két különböző módszert alkalmaztunk az antioxidáns aktivitás meghatározására, mivel azok alapelvei eltérőek. A DPPH módszer a szabad gyökök semlegesítésének képességét méri, míg a FRAP módszer a vasionok redukciójának képességét. Ezért ajánlott több módszer alkalmazása az antioxidáns aktivitás meghatározására, hogy jobban megértsük a vizsgált minták antioxidáns aktivitását.78
A tanulmány egyik legfontosabb megállapítása, hogy a *Pleurotus ostreatus* lakkáz NRC 620 70°C-on és 3,0 pH-értéken mutat optimális aktivitást. A lé derítésére általánosan használt más gombalakkázokhoz, például a *Trametes versicolor* és a *Ganoderma lucidum* lakkázokhoz képest a *P. ostreatus* NRC 620 nagyobb termikus stabilitást és savasabb pH-értéket mutat. A *Trametes versicolor* és a *Ganoderma lucidum* lakkázai jellemzően 50-60°C tartományban és 3,5 és 5,0 közötti pH-értéken mutatnak optimális aktivitást. Ez a különbség hozzájárulhat a lé derítési hatékonyságának javulásához, különösen a savas levek esetében, ahol az alacsonyabb pH-értékeken való stabilitás kritikus fontosságú. A *P. ostreatus* NRC 620 egyedülálló jellemzője, hogy a többi vizsgált gombalakkázhoz képest hatékonyan működik kihívást jelentőbb körülmények között is. Magasabb optimális aktivitási hőmérséklete potenciális előnyökre utal az ipari alkalmazásokban, például a gyorsabb reakciósebességre és a csökkent mikrobiális szennyeződésre. Alacsony pH-értéke, amely jól illeszkedik számos gyümölcslé savas természetéhez, hasznos lehet a gyümölcslé derítési folyamataiban. Ezek az eredmények indokolják a további kutatásokat a nagymértékű alkalmazás érdekében, így a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 életképes alternatívát jelent a hagyományos gombás lakkázforrásokkal szemben. A korábbi tanulmányokkal összehasonlítva azt találtuk, hogy az optimális hőmérséklet 60°C, az optimális pH pedig 3,0. 60°C-on 80 percig tartó reakció után a *Ganoderma lucidum* lakkáz visszatartotta a...46tevékenységének %-a.79 Kurniawati és Nicelle szerint80A *Ganoderma lucidum* enzimek kiváló vagy közepes stabilitást mutatnak 25°C-on és 5,0 és 8,0 közötti pH-értéken, valamint stabilitást 6,0 pH-n és 10 és 30°C közötti hőmérsékleten. Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a *Pleurotus ostreatus* enzimaktivitásának optimális pH-értéke 3,0, illetve 70°C volt. 40°C-on és 50°C-on két órán át történő inkubálás után az enzim aktivitásának 68,33%-át, illetve 59,61%-át tartotta meg. Továbbá a Pleurotus ostreatus NRC 620 lakkáz magas aktivitást mutatott széles hőmérsékleti tartományban, 50°C és 80°C között, közel elérve a maximális aktivitást (69%–98%), a maximális aktivitást 70°C-on figyelték meg.
Összefoglalva, a statikus körülmények között előállított NRC620 laskagomba-lakkáz optimális aktivitást és stabilitást mutatott a pH- és hőmérsékleti viszonyok széles tartományában, kiváló stabilitást mutatva más enzimforrásokhoz képest. A 10 mM MgSO₄ és CuSO₂ hozzáadása az enzimaktivitást körülbelül 21%-kal, illetve 35%-kal növelte. Almalévé feldolgozáskor az enzim csökkentette a pH-t és a viszkozitást, míg a fenoltartalom csak kis mértékben csökkent a tárolás során.
Az eredmények megerősítik a lakkáz élelmiszeripari, különösen az italok derítésében rejlő lehetőségeit. A fenolos vegyületek célzott lebontásával a lakkáz nemcsak a zavarosságot csökkenti és javítja az átlátszóságot, hanem enyhe üzemi körülmények között is megőrzi a gyümölcslevek minőségét. A hagyományos derítőszerekkel, például a zselatinnal, a bentonittal és a szilikagéllel ellentétben a lakkáz nem termel hulladékot, és nem távolítja el az italok kellemes aromáit, így környezetbarátabb és fenntarthatóbb alternatívát kínál. Továbbá, más enzimekhez és szűrési módszerekhez képest a lakkáz célzott és költséghatékony megoldást kínál a termékminőség feláldozása nélkül.
Kyomuhimbo, HD és Brink, HG. Réztartalmú lakkázok alkalmazásai és immobilizációs stratégiái; áttekintés. Heliyon 9, e13156 (2023).
Közzététel ideje: 2025. dec. 15.